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清华药学院刘刚课题组在《ACS传染病》发文报道新型硝基还原酶Rv2466c的荧光探针NFCs,可用于结核病的诊断和药物敏感评

日期:2019-06-20?|? 作者:本站原创?|? 15 人围观!

清华药学院刘刚课题组在《ACS传染病》发文报道新型硝基还原酶Rv2466c的荧光探针NFCs,可用于结核病的诊断和药物敏感评

最新研究成果|清华药学院刘刚课题组在《ACS传染病》发文报道新型硝基还原酶Rv2466c的荧光探针NFCs,可用于结核病的诊断和药物敏感评2019年3月27日,清华大学药学院刘刚教授课题组及其合作者在《ACSInfectiousDiseases》杂志上在线发表了题为基于新型硝基还原酶Rv2466c的结核分枝杆菌诊断和药敏实验的荧光探针(ANitrooxidoreductaseRv2466c-dependentFluorescentProbeforRapidMycobacteriumTuberculosisDiagnosisandDrugSusceptibilityTesting)的研究论文,报道了NFCs作为小分子荧光探针用于结核病诊疗的新发现。

这是该课题组通过合作研究于2014年在《JournalofMedicinalChemistry》杂志上发表关于NFCs可以选择性地高活性抑制复制型以及非复制型结核分枝杆菌(doi:/jm4019228.)以及2018年初在《ACSInfectiousDiseases》杂志上发表关于Rv2466c是结核分枝杆菌内Mycothiol(MSH)依赖的硝基还原酶(doi:/)的研究结果后,在结核病诊疗领域的又一研究进展。 在全球范围内,结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)引起的结核病(Tuberculosis,TB)是具有高致死率的传染病之一。

据WHO估计,仅2017年全球范围内:157万人死于结核病,新发现640万结核病案例;在新发现案例中有%为多药耐药型结核杆菌(MDR-TB)感染,累积有105个国家发现有广泛耐药型结核杆菌(XDR-TB)感染的病例;世界上近1/3的人口感染了潜伏性结核分枝杆菌。 治疗周期长,副作用大,对MDR-TB及XDR-TB不敏感是目前化学治疗结核病亟待解决的问题。

但是,在过去的40多年里仅有一个新结构类型的抗结核药物上市。 除此之外,结核病的诊断方法,特别是快速诊断、耐药诊断也长期处于缓慢的发展状态。

2014年刘刚课题组与合作伙伴首次报道基于(+)-CalanolideA改造的硝基呋喃香豆素类结构(nitrofuran-coumarins,NFCs)是一种针对活动性结核和潜伏性结核分枝杆菌的高效抑制剂。 (+)-CalanolideA是从马来西亚热带雨林植物藤黄科胡桐属植物长茎胡桐(Calophyllumlanigerum)中分离得到的具有抗HIV-1和抗Mtb活性的天然香豆素衍生物。

在Gates基金资助下,刘刚教授团队及其合作者通过筛选十余万个化合物发现Calanolide衍生物具有较好的抗活动性结核和潜伏性结核双重活性,并进一步细致研究了Calanolide的构效关系,优化出硝基呋喃香豆素类衍生物NFCs,对活动性结核和潜伏性结核的抑制活性均可达/mL(图1)。

此外,相对于其他常见的革兰氏阳性菌和阴性菌,NFCs展示出对Mtb的选择性抑制作用以及对感染人巨噬细胞的Mtb的高活性(图2)。 图1天然(+)-CalanolideA及其类似物的抗结核活性研究图2NFCs可选择性抑制Mtb并感染人巨噬细胞的Mtb该类化合物具有遗传毒性导致无法继续开发新药,但其新颖的作用机制引起了研究团队的兴趣。

通过遗传学,结构生物学,计算化学,生物化学和生物物理学等手段及方法揭示了与NFCs活性相关的酶Rv2466c,为一类新型的氧化应激硝基还原酶。 该酶需在小分子硫醇mycothiol(MSH)辅助下,将NFCs的硝基还原为氨基(图3),并产生抑菌作用。 Rv2466c、MSH、NFCs三者存在怎样的相互作用以及酶具体的还原机制是什么?该研究在结核病的诊疗过程中是否存在临床应用意义?刘刚教授团队为此进行了进一步研究。

实验结果可以推测,Mtb分泌的小分子硫醇MSH通过其乙酰基半胱氨酸取代的葡萄糖胺部分(acetylatedcysteine-glucosamine,AcCys-GlcN)结合Rv2466c,随后其巯基与与蛋白Cys19形成二硫键(mycothiolation)后,调节蛋白形成活性构象,从而允许NFCs的进入,并与蛋白的W21,N51和Y61的相互作用形成Rv2466c/MSH/NFCs(RvMN)三元复合物;随后,Rv2466c还原NFCs的硝基为氨基(图3),这个过程伴随着荧光的释放,可用于Mtb的快速诊断及药敏实验。 随后的临床转化实验证明:(1)NFC荧光检测技术用于临床痰样本的诊断,与对照方法MGIT960相比具有较高的一致性(曲线下面积:,敏感性:%,特异性:%,阈值:;(2)NFC荧光检测技术用于Mtb临床分离菌株的药敏实验,与临床微孔板药敏检测法及微孔阿尔玛蓝检测法(microplate-basedalamarBlueassay,MABA)对比一致性高;(3)NFC荧光检测技术可直接用于临床随机痰样本的药敏试验,可给出准确的MIC值。 综上,NFC技术是一种基于结核分枝杆菌内硝基氧化还原酶Rv2466c的荧光诊断探针分子,具有机制新颖、操作简便、成本低廉、高通量以及可获得准确MIC值等优点,有望成为一种新型、简便、经济、准确的结核病诊断以及耐药结核病筛选方法,有利于结核的个体化治疗。

图3Rv2466c依赖于MSH还原NFCs并释放荧光物质,可用于结核病的诊断和药物敏感性评价总的来说,刘刚团队及其合作者的这三项研究成果,讲述了NFC类分子,从具有抗结核活性、到治疗结核再到诊断结核这一艰难而又精彩的分子历程。

清华大学药学院刘刚教授是本文的核心通讯作者。

此外,首都医科大学附属北京胸科医院的孙照刚研究员合作研究讨论、临床实验的设计,为文章的共同通讯作者。 刘刚课题组博士生穆然、孙照刚课题组硕士生孔成成、刘刚课题组博士生于文俊及博后王洪耀为论文的共同第一作者。

清华大学医学院李海涛教授、美国康奈尔医学院SelinSomersan-Karakaya博士也参与了讨论,并给与了帮助。 该研究得到了自然科学基金委、北京结构生物学高精尖创新中心、以及北京科技委员会基金的支持和帮助。 原文链接:https:///doi//。


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